Untersuchung zum Phosphorylierungsstatus der katalytischen Untereinheit der PKA mittels proteomischer Techniken

ZUSAMMENFASSUNG: Das Phosphorylierungsmuster eines Proteins ist kein statischer Zustand, sondern vielmehr ein dynamischer Status, den es in der modernen funktionellen (Phospho-) Proteomik und Analytik abzubilden gilt. Klassischerweise erfolgt der Nachweis der Proteinphosphorylierung auf Peptid-Ebene mittels MS/MS Sequenzierung. Diese Standardmethode der shotgun Phosphoproteomanalytik vernachlässigt jedoch wegen den in LC MS/MS Analysen oftmals schwer detektierbaren Phosphopeptiden gerade den variablen und oftmals nur geringen Phosphorylierungsgrad vieler Phosphorylierungsstellen (P-Stellen). Mittels phosphospezifischer Anreicherungsstrategien und MS/MS Sequenzierung konnten an der Modellkinase PKA-Cα nach rekombinanter Expression in E. coli insgesamt acht P-Stellen identifiziert werden. Der Phosphorylierungsgrad wurde in Kooperation mit Dr. J. Seidler über quantitative Signalintensitätsmessungen bestimmt und zeigte eine nahezu vollständige Phosphorylierung von pS10, pS139, pT197 und pS338, während der Phosphorylierungsgrad für pS34, pS53, pS65 und pS259 zwischen <5 und 45 % variierte. Neben der Quantifizierung der P-Stellen wurde auch das Auftreten und die Verteilung definierter Phosphoformen der PKA-Cα untersucht und deren Abhängigkeit von der primären Aminosäureabfolge, dem Auftreten von zusätzlichen Modifikationen sowie den gewählten Expressions- und Reinigungsbedingungen aufgezeigt. Endogene, aus Säugergewebe isolierte PKA-Cα wies nur eine einzige Phosphoform mit den P-Stellen pT197 und pS338 auf. Auch in vitro autophosphorylierte rekombinante PKA-Cα, die zuvor dephosphoryliert worden war, wies eine zweifach modifizierte Phosphoform auf. Im Vergleich zum endogenen Protein ließ sich dieses Protein an S10 und S338 exzessiv phosphorylieren, wohingegen an T197 keine Autophosphorylierung nachzuweisen war. Das Ausbleiben weiterer Phosphorylierungen stellt in Frage, ob die Hyperphosphorylierung in E. coli ausschließlich auf Autophosphorylierungsprozessen beruht, was anhand einer nicht phosphorylierten, katalytisch inaktiven Variante von PKA-Cα (PKA-Cα K72H) vermutet wurde. Im Hinblick auf die funktionellen P-Stellen pT197 und pS338 erfordert diese Entdeckung sowie der unabhängige Nachweis, dass zellfrei exprimierte PKA-Cα nur an S338 phosphoryliert ist, eine Modifizierung des sequenziellen Vorhersagemodells, wonach die Phosphorylierung an T197 eine zwingende Voraussetzung für die nachfolgende Phosphorylierung an S338 ist. Ferner konnte über phosphomimetische Mutagenese die Funktionalität der Phosphorylierung an S53 innerhalb der glycinreichen Schleife der PKA-Cα und somit ein potenzieller Weg zur Regulation der enzymatischen Aktivität gezeigt werden. Ein weiterer möglicher upstream Regulator von PKA-Cα ist die Proteinphosphatase 5, die in der Lage war, die bislang als phosphatasestabil beschriebene P Stelle pT197 in vitro zu dephosphorylieren. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass der Phosphorylierungszustand eines Proteins von zahlreichen internen und externen Faktoren abhängt – eine Tatsache, die gerade für rekombinante Proteine, insbesondere enzymatisch aktive Kinasen, oft vernachlässigt wurde. Daher müssen auch in der shotgun Phosphoproteomanalytik P-Stellen nicht mehr nur identifiziert und quantifiziert werden, sondern die resultierenden Proteinphosphoformen differenziert auch in ihrem physiologischen Kontext beschrieben werden.

Analysen der beiden cis-regulierenden Sequenzelemente translational control element (TCE) und cytoplasmic polyadenylation element (CPE) in der Drosophila-Spermatogenese

Ein essentieller Bestandteil in dem Mechanismus der Translationskontrolle sind RNA-Pro­tein-Wechselwirkungen. Solche Interaktionen konnten in Translationssystemen an zwei unabhängigen cis-regulierenden Elementen durch in vitro-Bindungsanalysen mit individu­ellen rekombinanten Proteinen dokumentiert werden. Im Fall des translational control elements (TCE), welches ein konserviertes Sequenz-Ele­ment in der Mst(3)CGP-Genfamilie darstellt, wird eine negative Translationskontrolle durch die Bindung der Proteine CG3213, CG12470, CG1898, dFMR1, Exuperantia und Orb2 an diese Sequenz vermittelt (Stinski, 2011). Neben den in Bindungsstudien positiv getesteten Kandidaten dFMR1 und Orb2 (Stinski, 2011) wurde in der vorliegenden Dis­sertation CG3213 als weiterer direkter Bindungspartner an das TCE dokumentiert. Ein Abgleich der genomweiten Zusammenstellung von Proteininteraktionen in der Datenbank InterologFinder lieferte zwei weitere potentielle Kandidaten: CG34404 und CG3727. Al­lerdings schließen Northern-Analysen und das Proteinexpressionsmuster eine zentrale Rolle in der Drosophila-Spermatogenese für diese nahezu aus. In Kolokalisationsstudien einiger TCE-Komplex-Kandidaten mit CG3213 als Referenz konnten eindeutige Überein­stimmungen der Fluoreszenzmuster mit CG12470 in der postmeiotischen Phase be­schrieben werden, wohingegen mit Orb2 (postmeiotisch) und CG1898 (prämeiotisch) nur eine geringe Kolokalisation erkannt wurde. Punktstrukturen in den Verteilungsmustern sowohl von CG3213 als auch von CG12470 ließen sich nicht mit ER- und mitochondrien­spezifischen Markern korrelieren. Im Anschluss der Meiose konnte eine deutliche Intensitätserhöhung des CG3213-Proteins beobachtet werden, was eventuell durch eine veränderte Translationseffizienz zustande kommen könnte. Exuperantia (Exu) stellt einen bekannten Regulator für eine Reihe von translationskontrollierten mRNAs dar (Wang und Hazelrigg, 1994). Die Quantifizierungen der CG3213-mRNA in exu-mutantem Hintergrund bestätigen, dass auch die Transkript­menge der CG3213-mRNA durch Exu reguliert wird, was die obige Interpretation stützen würde. Für das zweite cis-regulierende Element, das cytoplasmic polyadenylation element (CPE), konnte eine direkte Bindung mit dem CPEB-Homolog in Drosophila (Orb2) gezeigt wer­den, welches auch eine Komponente des mst87F-RNP-Komplexes ist. Ein vermuteter Interaktionspartner dieses CPEBs ist Tob, weshalb die Verteilung beider Proteine in einem Kombinationsstamm verglichen wurde. In dem teilweise übereinstimmenden Fluoreszenz­muster ist Tob an den distalen Spermatidenenden auffallend konzentriert. Das gesamte Tob-Muster jedoch legt eine Verteilung in den Mitochondrien nahe, wie die MitoTracker®-Färbung belegt. Somit wurde erstmals ein Mitglied der Tob/BTG-Genfamilie in der Droso­phila-Spermatogenese mit Mitochondrien in Verbindung gebracht. Die Lokalisierung die­ser Proteine ist bislang unklar, jedoch konnte eine Kernlokalisation trotz der N-terminalen NLS-Sequenz mit Hilfe einer Kernfärbung ausgeschlossen werden.